Verständnis von Küvettenvolumen, Material, Weglänge usw.
Ein Spektrophotometer ist eine ideale Wahl für die Messung von interessierenden Materialien Absorption oder Durchlässigkeit auf ein bestimmtes Spektrum Wellenlänge, um auf diese Weise Daten über die Substanz zu erhalten Konzentration und Reinheit . Eine Küvette ist ein kleines Gefäß, das Proben enthält, die für spektroskopische Messungen verwendet werden und in den Spektrophotometern platziert sind. Küvetten bestehen aus verschiedenen Größen , Bände, und Materialien und sollte sein transparent für den angestrebten Wellenlängenbereich.
Arten von Küvetten
Für die photometrischen Messungen flüssiger Lösungen müssen die Proben in einem vordefinierten Format im optischen Lichtweg eines Photometers (Spektrophotometer, Fluorometer oder Kolorimeter) positioniert werden. Die Standardoption für diese Anwendung sind Küvetten, Probenbehälter mit 2 oder 4 optisch klaren Fenstern.
Abbildung 1. Standardlänge des optischen Pfades von Küvetten
Es gibt so viele Arten von Küvetten (wir haben über 260 Küvetten auf unseren Websites aufgelistet), selbst wenn der Bereich auf diejenigen beschränkt wird, die nur für Absorptionsmessungen im Bereich der UV-vis-Spektrophotometrie verwendet werden.
Verschiedene Küvettenschemata, a – e sind Zellen mit Standardgröße
Probenlösung ist untergebracht innerhalb der red Linien der Küvetten oben. Die Küvettenzellen a – e haben eine Außengröße von 12,5 x 12,5 x 45 mm.
- a: 10 x 10 mm Fluoreszenzküvette mit innerer Größe;
- b: 2 × 10 mm Halbmikrofluoreszenzküvette;
- c: 2 × 10 mm Halbmikroabsorptionsküvette;
- d: 2 × 10 mm Submikrovolumenküvette;
- e: 2 x 2 mm Fluoreszenzküvette mit innerer Größe.
Fluoreszenzküvetten sind Küvetten mit 4 klaren Wänden (einige spezielle Küvettentypen haben drei transparente Wände), während Absorptionsküvetten normalerweise 2 Wände klar sind. Die Küvetten f und g sind Beispiele für Küvetten ohne Standardabmessung, die auch als Küvetten mit kurzer Weglänge bezeichnet werden. Die Weglänge und die äußere Größe sind kleiner als bei Standardküvetten.
Die Weglänge der Küvette ist die Länge des Lichts, das die Küvette durchquert.
Die Küvetten a und c haben eine Weglänge von 10 mm. Die Küvettenzellen b, c und f haben die gleichen Innenabmessungen (2 x 10 mm) und die Küvetten e und g haben die gleichen Innenabmessungen (2 x 2 mm), jedoch unterschiedliche Außenabmessungen.
HINWEIS: Die Außenabmessungen der Küvetten f und g sind nicht Standard und gelten in dieser Diskussion nicht, sofern nicht ausdrücklich darauf hingewiesen wird. Nichtsdestotrotz können diejenigen, die mit nicht standardmäßigen Küvetten vertraut sind, diese jederzeit verwenden, indem sie geeignete Adapter oder Probenhalter verwenden, die speziell entwickelt wurden.
Die Küvette c ist eine Halbmikrovolumen-Absorptionsküvette (2 klare Wände). Es hat zwei dunkle (schwarze) Wände, die kein Licht durchlässt. Dies ist nützlich, da eine Küvette mit einer Weglänge von 10 mm mit einem viel kleineren Volumen verwendet werden kann und jegliches Licht, das nicht durch die Lösung tritt, vor dem Erreichen des Lichtdetektors geschützt wird.
Es ist sehr wichtig, in einem Absorptionsexperiment keine Küvette b anstelle von Küvette c zu verwenden. Die Verwendung von b bei der Absorptionsmessung führt zu einer falschen Ablesung, selbst wenn der Hintergrund der Küvette b gemessen wurde. Die Küvette c ist dagegen nicht für eine Emissionsmessung geeignet, die üblicherweise mit einer anderen Geometrie durchgeführt wird.
Die Faktoren wie Probenmerkmale, Volumenverfügbarkeit, Konzentration und Art der durchzuführenden Messungen sollten die Entscheidung bei der Auswahl der geeigneten Küvette für Ihre Anwendungen beeinflussen.
Figur 2. Verschiedene Arten von Küvetten
Küvetten nach Volumen
Die am häufigsten verwendete Küvette ist eine quadratische Küvette mit einer Außenabmessung von 12,5 x 12,5 mm und einer Höhe von 45 mm und eine Innengröße von 10 x 10 mm. Dies ist eine Standardabmessung, für die die meisten Spektralphotometer und Fluorometerhalter ausgelegt sind. M.Selbstverständlich sind auch alle Arten von größeren und kleineren Küvetten erhältlich. Es sind auch Adapter erhältlich, die kleinere Küvetten mit kurzer Weglänge in den Standardhalter ermöglichen, der quadratische Küvetten von 12,5 mm x 12,5 mm aufnehmen kann.
Mit dieser Außengröße sind die Küvetten bei erhältlich< 100 Mikroliter ( Submikroküvetten ) auf einige hundert Mikroliter ( Halbmikroküvetten ) bis Küvetten mit Standardvolumen von 3,5 Millilitern. Natürlich ein größeres Volumen an Küvetten (Makrotyp ) größer als 3,5 ml ist ebenfalls erhältlich und die externe Größe ist größer.
Figur 3. Das Volumen der Küvetten ist bei gleichem Platzbedarf unterschiedlich
Wie wird das Küvettenvolumen bestimmt?
Das Volumen der Küvette bezieht sich auch auf das Volumen der Probenflüssigkeit, für das sie ausgelegt sind.
Eine quadratische Küvette von 1 cm nimmt 1 ml Flüssigkeit pro 1 cm Höhe auf. Daher kann eine Küvette mit einer Höhe von 43,75 mm (45 mm – 1,25 mm Basisdicke) bis zu 4,375 ml Flüssigkeit aufnehmen. Wenn die Küvette zu 80% gefüllt ist, beträgt das Gesamtvolumen 3,5 ml, was als sogenanntes Volumen bezeichnet wird Standardvolumen .
4,375 ml × 80% = 3,5 ml
Der Grund 80% ist, dass Sie die Küvette nie mehr als 80% füllen sollten. Wenn sich die Flüssigkeiten zu nahe am Rand der Zelle befinden (> 80%) können leicht verschüttet werden und verursachen während der Messungen viele Probleme.
Was sind die Optionen für die Lautstärke der Küvette?
Bei der Auswahl einer Küvette stehen vier Arten von Volumenoptionen zur Verfügung:
- Das Messvolumen von a Makro Die Küvette ist größer als 3,5 ml (7 – 35 ml).
- Eine Standardvolumenküvette fasst ein Messvolumen von 3,5 ml.
- Ein Halbmikroküvettenvolumen enthält Proben von 0,35 ml – 1,7 ml. Unter diesen Arten von Küvetten mit kurzer Weglänge kann eine Küvette erforderlich sein Anschlüsse oder Abstandhalter .
- Eine Submikrovolumenküvette fasst Proben zwischen 20 ul und 350 ul.
Figur 4. Makroküvetten
Abbildung 5. Standard 3,5 ml Küvetten
Was ist das? Auswahl an Mikrovolumen-Küvetten für begrenzte Proben?
Für viele biologische Messungen sind die Proben so wertvoll und einige Milliliter des Volumens sind schwer zu zielen. Das erforderliche Volumen kann verringert werden, indem zwei oder vier Seiten der Küvetteninnenwände dicker gemacht werden.
Beispielsweise ist eine 4-mm-Küvette eine Küvette mit einer Außengröße von 12,5 mm × 12,5 mm und einer Innengröße von 4 mm × 10 mm. Eine solche 4-mm-Küvette erfordert ein Flüssigkeitsvolumen von 1,4 ml pro – 45 mm Höhe; In ähnlicher Weise entspricht eine 1 mm Küvette einem Flüssigkeitsvolumen von 0,35 ml pro – 45 mm Küvettenhöhe.
Siehe die folgenden Beispiele:
Abbildung 6. Halbmikroküvetten mit quadratischen Basen von 12,5 * 12,5 mm
Abbildung 7. Montage und Abstandshalter, die Küvetten mit kurzer Weglänge in den Standardhalter ermöglichen
Spektralphotometer und Fluorometer messen an einem von drei optischen Standardstrahlen Z Abmessungen (der Abstand vom Boden der Küvette bis zur Mitte der Messöffnung) – entweder 8,5, 15 oder 20 mm – je nach Instrument.
Standardküvetten sind normalerweise geradewandig und passen in die meisten Spektrophotometer. Andererseits, Halbmikroküvetten haben den gleichen äußeren Fußabdruck, aber ihr Inneres ist typischerweise auf eine begrenzte Probenmenge verjüngt. Unabhängig davon, die Submikroküvette dient zur Messung durch die Probe bei einer bestimmten Z-Abmessung in der Kammer. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Küvette, die Sie für Ihre Probenmessungen auswählen, mit der Höhe der Z-Abmessung Ihres Instruments kompatibel ist.
Abbildung 8. Sub-Mikrovolumen-Küvetten unterscheiden sich in den Z-Abmessungen
Weiterführende Literatur: Z Abmessungen von Ultra Micro Volume Cuvettes (Liste von 474 Instrumentendaten)
Küvette nach Weglänge
In einem typischen Forschungslabor hat das Spektrophotometer eine Standardkammergröße, in der eine Küvette untergebracht ist, damit eine bestimmte Lichtwellenlänge durch die Probenlösung hindurchtreten kann. Dieser Abstand zwischen den parallelen optischen Fenstern der Küvette ist genau hergestellt und bekannt, was als bekannt ist Küvettenweglänge .
Abbildung 9. Küvettenpfadlänge
Das Standardpfadlänge einer Küvette beträgt jedoch 10 mm a kürzere Weglänge und längere Weglänge ist auch auf Lager gelistet. Kürzere Weglängen Küvetten haben normalerweise ein kleineres Volumen und eine längere Küvettenweglänge macht das Küvettenvolumen größer.
Hier sind einige wichtige Küvettenmerkmale zu beachten:
- Bei Probenmessungen, die in geringen Konzentrationen gefunden werden, z. B. RNA, einzelsträngige DNA und Oligonukleotide, wird eine ausreichend lange Pfadlänge empfohlen, damit die Datenwerte innerhalb des linearen Messbereichs des Instruments liegen. Die Standardgröße beträgt 10 mm Weglänge. Die gute Nachricht ist, dass Küvetten mit einer optionalen Weglänge jetzt bei uns erhältlich sind (doppelte Pfadlänge ).
Abbildung 10. 10-mm-Küvette, die um 90 Grad gedreht werden kann, um eine Ablesung bei einer Pfadlänge von 2/5 mm zu ermöglichen
- Das Messen einer Probe mit kleinem Volumen über eine kurze Weglänge ist einfacher und schneller als das Verdünnen einer Probe in mehreren Schritten. Da weniger Pipettierschritte übertragen werden, sind die Messwerte höchstwahrscheinlich zuverlässiger und genauer.
- Halbmikrovolumen-Küvetten mit einer kürzeren Weglänge können mit Küvettenabstandshaltern oder Halterungen verwendet werden. Diese Testergebnisse mit Kurzwegküvetten sind genauer und vertrauenswürdiger bei der Messung konzentrierter Proben wie Nukleinsäuren oder Proteine im Vergleich zu verdünnten Probenpräparaten.
Abbildung 11. Küvetten mit kurzer Weglänge und Halterung
Weiterführende Literatur: Auswahl der UV-vis-Küvette: Küvettenmaterial und Weglänge
Küvette nach Materialien
Küvetten aus unterschiedlichen Materialien können in unterschiedliche Spektralbereiche passen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die ausgewählte Küvette für die spezifischen Wellenlängen transparent ist, wenn die interessierenden Proben gemessen werden. Eine ideale Wahl des Küvettenmaterials würde auch nur Proben (meist flüssige Lösungen) und aufnehmen interagiert nicht mit den Proben bei der Messung verwendet.
Küvetten haben eine Lichtdurchlässigkeit von a begrenzter Wellenlängenbereich , und haben brechend Index dielektrische Fehlanpassung (unterschiedlicher Brechungsindex von Luft und Lösungen) und kann haben Schäden wie Kratzer, die sehr klein und unbemerkt sein können. Alle diese Faktoren können die Messung des Ergebnisexperiments beeinflussen.
Die Wellenlängen der zu verwendenden Küvette werden durch das Küvettenmaterial bestimmt. Eine ausreichende Transmission ist für die Küvette wichtig, damit sich die Lichtschwächung der transparenten Wände der Zelle nicht negativ auf das Messergebnis auswirkt.
Die Transmission für alle Wellenlängen beträgt nicht einheitlich für optische Standardküvetten und am häufigsten die spektrale Transmission in der UV oder IR ist der Grenzbereich. Der sichtbare Bereich wird üblicherweise von fast allen Küvettenmaterialtypen übertragen.
Es gibt jedoch KEINE universelle Vereinbarung der minimalen Transmission, die für einen bestimmten Wellenlängenbereich erforderlich ist. Und unterschiedliche Standards werden von verschiedenen Herstellern angewendet (variiert zwischen 10% und 90%).
Verwendbarer Übertragungsbereich aus unterschiedlichem Material
| Material | Übertragungsbereich |
| Far UV Quarz | 170 – 2700 nm |
| Nahe IR Quarz | 250 – 3500 nm |
| UV-Quarz | 220 – 2500 nm |
| Optisches Glas | 340 – 2500 nm |
| Plastik | 380 – 850 nm |
| UV-Kunststoff | 220 – 900 nm |
Diese Tabelle sollte nicht wörtlich genommen oder als Referenz verwendet werden. Es wird nur verwendet, um dem Leser verständlich zu machen, dass der nutzbare Küvettenbereich erheblich variieren wird. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die zu verwendende Küvette im interessierenden Wellenlängenbereich funktioniert.
Quarzmaterial hat die höchste Transmissions- und Temperaturbeständigkeit, ist vor allem im sichtbaren Licht- und UV-Bereich transparent und ist eine geeignete Wahl bei der Messung von Proben im UV-Lichtspektrum.
Glas und Plastik Materialien sind normalerweise für sichtbares Licht (380-700 nm) transparent, absorbieren jedoch im UV (190 – 340 nm) Wellenlängenbereiche. Daher sind Glas- und Kunststoffküvetten ideal für kolorimetrische Proteinassays oder zur Messung der Bakterienkulturdichte, die kann nicht zur Konzentrations- und Reinheitsmessung von Proben im UV-Bereich verwendet werden. Kunststoffküvetten sind kostengünstig und wegwerfbar.
Kunststoffküvetten, die unter 380 nm arbeiten, sind verfügbar, der Rest der meisten transparenten Kunststoffküvetten jedoch nicht geeignet für Fluoreszenz- oder Absorptionsexperimente.
Tatsächlich führt der Herstellungsprozess (Oberflächenqualität und Wandreinheit) zu einer Lichtdämpfung (Absorptionsrate). Daher kann die Küvettenleistung markenübergreifend unterschiedlich sein. Darüber hinaus verwenden viele Hersteller ihre eigenen Materialien und Oberflächenbeschichtungen, um ihre Übertragungsreichweite zu erhöhen und / oder ihre Küvettenkosten zu senken.
Hinweis: Eine hohe Transmission kann erforderlich sein, um aussagekräftige und vertrauenswürdige Ergebnisse zu erzielen, die Probleme an den Rändern der Küvettenübertragungsbereiche verursachen können.
Weiterführende Literatur:
Die Küvettentypen haben Vor- und Nachteile. Hier finden Sie weitere Tipps zur Auswahl der am besten geeigneten Küvette für genaue und zuverlässige Probenmessungen.
Weiterführende Literatur: Auswahl der UV-vis-Küvette: Küvettenmaterial und Weglänge
Wie treffe ich die Entscheidung?
Die Wahl des Küvettentyps hängt vom zu verwendenden Instrument, der Art des Experiments und der Probe selbst ab. Es ist wichtig, dass die Küvetten und Zellen wie haben hohe Übertragung Dies ist für bestimmte gemessene Wellenlängen möglich, sodass wir das Material normalerweise nicht nur auf den linearen Bereich des Photometers beschränken. Quarzküvetten haben die höchste Transmission unter allen Materialien.
Abbildung 12. Quarzküvetten mit höchster Durchlässigkeit
Die Anforderungen an die Ausrüstung erfordern, dass die Küvette mit dem Instrument kompatibel ist. Das äußere Größe der Küvette, weil sie in den Küvettenhalter passen muss, ist von großer Bedeutung, und beachten Sie auch die Höhe der Messkammer.
Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Lichtstrahlposition ( Z-Dimension): Die Lichtquelle muss in der Lage sein, durch das optische Fenster der Küvetten zu gelangen. Dies ist besonders wichtig für Küvetten mit Submikrovolumen und sehr kleinen Öffnungen. Die klaren Fenster für Lichtstrahlen können sehr klein sein (dh 2 mm x 5 mm). Wenn nicht richtig gewählt Z-Dimension (Lichthöhe) sind die Mikroküvetten möglicherweise nicht kompatibel und können nicht verwendet werden. Übliche Z-Abmessungen sind 8,5 mm, 15 mm und 20 mm.
Abbildung 13. Kleine Fensterküvetten Z-Maß von 8,5 15 20 mm
Der nächste wichtige Faktor ist die Messung von spektrale Wellenlängen an den Anwendungen beteiligt. PMMA-, Polystyrol- oder optische Glasküvetten sind nur im sichtbaren Bereich transparent. Bei Messungen werden UV-Wellenlängen von weniger als 300 nm , Quarzküvetten oder IR-Quarz Es sollten Küvetten mit ausreichender Durchlässigkeit verwendet werden.
Abbildung 14. Absorption von Küvetten aus Quarz- oder Glasmaterial zwischen 220 nm und 400 nm
Temperaturgesteuerte Küvette
Für jene Methoden, die auf Reaktionen an einem bestimmten beruhen Temperatur und Absorption Messung über die Zeit, Heizung und effizient Temperaturkontrolle der Probe während des Prozesses ist wesentlich. In diesem Fall sollte neben einer ausreichenden Materialfestigkeit auch die Kontaktfläche zwischen der Küvettenwand und dem temperaturgesteuerten Küvettenschaft so groß wie möglich sein. Daher können bei temperaturgesteuerten Anwendungen bestimmte Küvetten wie z Makroküvetten Vorteile bieten.
Weitere Faktoren, die bei der Auswahl einer Küvette berücksichtigt werden müssen, sind :. chemische Resistenz , die Probe Volumen und Konzentration zur Hand.
Chemische Beständigkeit der Küvette
Das Material, aus dem die Küvette hergestellt wird, ist relativ weniger wichtig, wenn es sich bei der Probe um eine handelt wässrig Lösung. Kunststoff-, Glas- oder Quarzküvetten funktionieren und Sie können sogar die günstigsten NRC-geklebten Küvetten auswählen.
Wenn organische LösungsmittelAndererseits sind Glas- und Quarzküvetten die bevorzugte Wahl, da diese im Vergleich zu Kunststoffalternativen robuster sind. Und das NRC funktioniert nicht mit organischen Lösungsmitteln. Stattdessen sollten Sie CRF- oder HTR-Versionen verwenden.
Abbildung 15. Küvettentypen unterscheiden sich in der chemischen Beständigkeit
* HTR : Hochtemperaturbeständig. Höchste Qualität für fortgeschrittene Experimente. Diese Küvettentypen werden geschmolzen und einteilig mit außergewöhnlicher Beständigkeit gegen hohe Temperaturen hergestellt (<1200 ℃) und ätzende Chemikalien. Übertragung ist 83% Über. Null Daten lesen Variation ist auf Anfrage erhältlich (Standard< 0,3%) für 2 oder mehr Stück. HTR-5 bedeutet, dass die Küvette 5 klare Wände hat.
- Hinweis: Diese HTR-Küvetten können mit den beliebtesten verwendet werden organische Lösungsmittel , ebenso gut wie Säuren und Basen. Sie sind mit Chemikalien wie Aceton, Butanon, DMF und konzentrierter Salzsäure kompatibel.
* CRF : Chemisch beständig verschmolzen. Bestseller, Verkaufsschlager, Spitzenreiter! Diese Art von Küvetten ist gegen die meisten organischen Lösungsmittel, Säuren und Basen beständig. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass einige Chemikalien die Bindungskanten beflecken. Es ist eine billigere Alternative zum HTR-Typ. CRF-H hat eine höhere Übertragung (83% gegenüber 80%) als CRF und die gleiche Übertragung mit HTR.
- Hinweis :: Bitte verwenden Sie die CRF-Küvette nicht, um Chemikalien längere Zeit zu lagern. Reinigen Sie es nach Gebrauch.
* * NRC: Nicht chemikalienbeständig. Diese Art von Küvette wird mit Klebstoff zusammengesetzt.
- Hinweis: Bitte beachten Sie, dass diese NRC-Küvetten nicht mit Benzol, Toluol, Königswasser, Ethanol, ätzenden Lösungen oder ähnlichen Substanzen verwendet werden dürfen, da sie die Bindungen zwischen den Teilen beeinträchtigen und zum Auslaufen der Küvette führen können. UNTERLASSEN SIE Spülen Sie die Küvette zur Reinigung mit Ethanol oder ähnlichen Lösungen.
Weiterführende Literatur: Erklärung der HTR-, CRF-, NRC- und chemischen Beständigkeit
Sehr kleines Probenvolumen
Wenn nur wenige Muster verfügbar sind, wird die Wiederverwendung der Probe für die folgenden Messungen kann berücksichtigt werden. In diesem Fall wird die Verwendung von Einwegartikeln empfohlen Kunststoffküvetten. Das Kontaminationsrisiko wird minimiert, wenn die Kunststoffküvetten einzeln verpackt sind und eine angemessene Reinheitsqualität aufweisen.
Alternative, Submikroquarzküvetten kann ausgewählt werden, die für die Verwendung mit extrem ausgelegt sind Mikroküvettenvolumen .
- Submikro- oder Mikrovolumenküvetten können sein wiederverwendetDadurch entfällt die Notwendigkeit, den Vorrat an Verbrauchsküvetten kontinuierlich aufzufüllen. Es ist uns möglich, wertvolle unverdünnte Proben für einige nachgeschaltete Messungen zu gewinnen, insbesondere für solche, bei denen Sterilität kein Muss ist.
Abbildung 16. Sub-Mikroküvetten
Probenkonzentration und Küvettenweglänge
Das Probenkonzentration beeinflusst auch die Auswahl der Küvette, da jedes Instrument eine obere Detektion hat Grenze. Beispielsweise kann eine doppelsträngige DNA bis zu einer maximalen Konzentration von 100 μg / ml genau quantifiziert werden, wenn ein Spektrophotometer mit einem linearen Messbereich von bis zu 2 A und einer Küvettenweglänge von 10 mm verwendet wird.
Lösungen mit höherer Konzentration müssen entweder verdünnt werden oder eine Küvette mit a kürzere Weglänge kann verwendet werden, um die Verdünnung zu simulieren. Bekannt aus dem Beer-Lambert-Gesetz Bei einer Weglänge von 1 mm Küvetten kann die dsDNS-Konzentration bis zu 1.000 µg / ml betragen.
Erweiterte Lektüre: UV-sichtbares Spektralphotometer-Setup und Beer-Lambert-Gesetz
Im Allgemeinen weisen Quarz- und Glasküvetten eine höhere Transmission und Genauigkeit von Spektroskopiemessungen auf, und diese Küvetten können viel häufiger wiederverwendet werden. Die Kunststoffküvette ist jedoch billig und einfach zu verwenden, muss nicht gereinigt und Kreuzkontaminationen vermieden werden, was sie zu einer hervorragenden Wahl für Protein-, DNA- und RNA- sowie wässrige Lösungen macht.
Das ist alles für heute! Vielen Dank für Ihre Zeit beim Lesen!
Das Cuvet.Co-Team
